Fajčenie a jeho vplyv na vybrané parametre bronchoalveolárnej laváže - experimentálna štíudia 

Marta Hurbánková,  Silvia Černá,  Milan Beňo, Martina Valachovičová,

Zuzana Kováčiková, Soňa Wimmerová

Slovenská zdravotnícka univerzita, Limbová 12, 833 03 Bratislava.

 

Súhrn

            Choroby pľúc (obštrukčné, fibrotické, nádorové), ktoré sú dôsledkom znečisteného ovzdušia, vrátane fajčenia, majú vzostupný trend. Spomínané ochorenia majú negatívny dopad na ekonomiku úbytkom pracovnej sily a zvýšenými nákladmi na zdravotnú a sociálnu starostlivosť. V našej práci sme sa zaoberali účinkom cigaretového dymu na vybrané parametre (zápalové, cytotoxické a parametre oxidačného stavu) bronchoalveolárnej laváže (BAL) u potkanov. Výsledky experimentálnej štúdie ukázali, že 6-mesačná inhalácia  8 cigariet denne významne zmenila mnohé vyšetrené biomarkery, čo signalizuje prebiehajúce patologické procesy v pľúcach. Prítomý zápal môže zohrávať významnú úlohu v navodení genotoxicity a karcinogenity vplyvom fajčenia. 

 

Kľúčové slová: cigaretové fajčenie, bronchoalveolárna laváž, parametre: zápalové, cytotoxické, antioxidačného stavu

 

Úvod

Jednou z príčin nárastu pľúcnych ochorení v dôsledku znečisteného ovzdušia je aj fajčenie. Mnohé známe polutanty, ktoré vznikajú z environmentálnych a priemyselných zdrojov ako sú benzen, formaldehyd, olovo a arzen, vyskytujú sa  tiež v cigaretovom dyme. Tabakový dym obsahuje okolo 4800 substancií, 69 dokázaných karcinogénov a množstvo toxických substancií, z ktorých mnohé sú vysoko reaktívne. Cigaretový dym je komplexná zmes, ktorá je zložená z  mnohých identifikovaných zložiek, obsahuje oxidanty a rôzne toxické látky, ktoré poškodzujú predovšetkým pľúca. Aktivuje zápalové bunky, ktoré generujú voľné radikály, enzýmy a bioaktívne látky. Rovnováha medzi poškodením a opravou pľúcnych buniek je dôležitým faktorom pri vzniku a rozvoji chorôb vyvolaných cigaretovým dymom (1, 2).

Práve z tohto dôvodu je potrebné sledovať  toxicitu tabakového dymu ako celku. Vnašej práci sme sledovali vplyv tabakového dymu  na vybrané zápalové a cytotoxické parametre bronchoalveolárnej laváže v experimente na potkanoch. Fajčenie je chronicky pôsobiaca noxa, ktorej ireverzibilné následky sa prejavujú až po dlhodobej inhalácii cigaretového dymu. Podľa WHO je fajčenie zodpovedné za vznik najmä nasledovných skupín ochorení:

1.  30 % nádorových chorôb s najvýraznejším podielom rakoviny pľúc (90% u mužov a 70% u žien), ale i nádorových chorôb úst, hrtana, pažeráka, žalúdka, pankreasu, hrubého čreva, konečníka, pečene, močového mechúra, prsníka a čípku maternice.

2.  20 % kardiovaskulárnych chorôb – ICHS, ateroskleróza a ischémia ciev dolných končatín.

3.  75 % chronickej bronchitídy, ktorá môže vyústiť do chronickej obštrukčnej choroby pľúc a emfyzému.  

Okrem uvedených ochorení  má fajčenie dokázateľnú súvislosť s výskytom cerebrovaskulárnych ochorení, komplikácií v tehotenstve a pri pôrode, nepriaznivý účinok na plod a novorodeneckú úmrtnosť. Každých 10 sekúnd na svete zomrie 1 človek na následky fajčenia (1).

Podľa IARC (International Agency for Research on  Cancer):

·        priamy účinok cigaretového dymu (mnohé jeho zložky) je klasifikovaný ako humánny karcinogén a je zaradený do skupiny 1.

·        ako humánny karcinogén je klasifikovaný aj tabakový dym u pasívnych fajčiarov (tabakový dym v životnom prostredí – skupina 1)   (3)

Spomínané ochorenia majú nesmierne závažný dopad na ekonomiku prostredníctvom strát, ktoré vznikajú úbytkom pracovnej sily a nákladom na zdravotnú a sociálnu starostlivosť. Navyše vysoký výskyt spomínaných ochorení bráni rýchlejšiemu vzostupu dĺžky života nášho obyvateľstva. Na Slovensku zomiera na choroby súvisiace s fajčením ročne asi 20 tisíc osôb. Je dokázané, že život fajčiarov sa skracuje asi o 8 -10 rokov (priemerne o 5 min. pri vyfajčení jednej cigarety). Absolútna väčšina ľudí, ktorí zomreli na infarkt alebo rakovinu pľúc, boli fajčiari. Z toho dôvodu sme našou prácou chceli prispieť k  poznaniu patomechanizmu pľúcnych poškodení vzniknutých vplyvom fajčenia.

Cieľom práce bolo:

zistiť účinky fajčenia na vybrané zápalové,  cytotoxické prametre a parametre oxidačného stavu bronchoalveolárnej laváže,

zistiť vplyv fajčenia na nešpecifické bunkové obranné mechanizmy,

z analýzy  výsledkov zistiť, ktoré  pľúcne parametre zohrávajú významnú         úlohu v obrane ako aj patomechanizme pľúcnych poškodení po                         cigaretovom fajčení,

Sledovaním vybraných citlivých markerov chceme zistiť ich podiel

   na obrannom mechanizme, ako aj patomechanizme pľúcnych ochorení v         dôsledku fajčenia.

 

 

Materiál a metódy

 

V pokuse sme použili samcov Wistar potkanov (Anlab, Praha, Česká republika) s hmotnosťou 194,3 g (kontrolná skupina) a 192,2 g (exponovaná skupina)g na začiatku pokusu. Zvieratá sme chovali za štandardných  podmienok  predpísaných pre chov laboratórnych zvierat. Dostávali konvenčné granulované  krmivo  ST1 (TOP-Dovo, Dubové, Slovenská republika) a pitnú vodu ad libitum.

Pri inhalácii cigaretového dymu boli zvieratá umiestnené v špeciálnej inhalačnej komore (Tobacco and Health Research Institute - THRI, Lexington, KY, USA), do ktorej sa čerpadlom vháňal hlavný prúd cigaretového dymu z cigariet typu 1R1 (THRI, Lexington, KY, USA). Množstvo prečerpaného dymu sme kontrolovali na základe váženia častíc (total particulate matter –TPM) zachytených na filtri typu Cambridge (THRI, Lexington, KY, USA). Zvieratá (n=6) inhalovali tabakový dym denne, okrem sobôt a nedieľ,  po dobu 6 mesiacov dve hodiny denne (85 mg TPM  /m3 vzduchu, približne 8 cigariet). 

Po šiestich mesiacoch sme zvieratá utratili  exsangvináciou (prerezaním vena cava caudalis) v  i. p. tiopentalovej narkóze (150 mg/1kg). Bronchoalveolárnu laváž (BAL) sme robili modifikovanou metódou podľa Myrvika (4). Pľúca sme premývali 3 x 5 ml výplachového roztoku. Takto získanú lavážnu tekutinu (BALF) sme odstreďovali 10 minút pri 4o C a 400 g.  V našej práci sme použili natívnu laváž a sediment BAL buniek (doplnený fyziologickým roztokom na koncentráciu 106 buniek/ml).

Sledované zápalové a cytotoxické parametre BAL

Podrobný popis metodík uvádza práca autorov Hurbánková a Kaiglová (5)

·        oxidačné poškodenie u potkanov sme zistili pomocou kométového testu na alveolárnych makrofágoch  a TII bunkách, ktoré boli vyizolované z pľúcneho tkaniva.

Výsledky:

Výsledky subchronického účinoku fajčenia na vybrané zápalové a cytotoxické parametre udáva tabuľka 1.

V porovnaní s kontrolnou skupinou sme zistili:

·        štatisticky významné zvýšenie % polymorfonukleárnych leukocytov, % lymfocytov a  % nezrelých foriem AM,

·        štatisticky významné zníženie viability AM,  % fagocytovej aktivity AM a  % AM z diferenciálneho obrazu buniek BAL,

·        šesť mesačné fajčenie významne neovplyvnilo počet buniek a počet AM v BAL ako aj % dvojjadrových buniek v BAL.

 

 Výsledky sme vyhodnotili Wilcoxonovým testom.

 

   Tab. 1.  BAL PARAMETRE PO 6-MESAČNEJ INHALÁCII CIGARETOVÉMU DYMU

PARAMETRE  BAL

 

KONTROLNÁ SKUPINA

 

EXPONOVANÁ SKUPINA

( 8 cigariet denne )

Počet Le    (10 3 )

1877,5 (1762,0; 2091,0)

1986,5 (1702,5; 470,63)

Počet AM  (10 3 )

1406,5  (1350,0; 1648,25)

1399,5  (1228,5; 1845,0)

AM %

98,0  (98,0; 98,0)

¯ 86,5**  ( 85,25; 87,75)

PMNL  %

1,0  (1,0; 1,0)

­ 9,5 **  (7,5; 10,75)

Ly  %

1,0  (1,0; 1,0)

­ 4,0**  (4,0; 4,75)

nezrelé formy AM  %

8,5  (7,25; 9,75)

­ 22,5 **  (18,75; 30,0)

dvojjadrové bunky  %

2,5  (2,0; 3,0)

­ 3,0  (3,0; 3,75)

viabilita AM  %

90,0  (89,25; 90,75)

¯ 81,5 **  (78,5; 83)

fagocytová activita AM  %

23,5  (20,75; 28,5)

­ 12,5 **  (12,0; 13,75)

Hodnoty predstavujú mediány a 25. a 75. percentil;  ** p<0,01 

          ¯ zníženie alebo ­ zvýšenie hodnôt oproti kontrole

 

Tab. 2. Charakteristika súboru a oxidačné poškodenie DNA  u exponovanej skupiny potkanov v porovnaní s kontrolnou skupinou.

 Parametre

kontrola

exponovaná skupina

Hmotnosť zvierat na začiatku experimentu (g)

194,3 ± 8,2

192,2 ± 9,8

Hmotnosť zvierat po utratení (g)

395,7± 19,3

413 ± 14,4

hmotnosť pľúc (g)

1,6 ± 0,1

1,3 ± 0,1

relatívna hmotnosť pľúc

0,0042 ± 0,0003

0,003099 ± 0,00028

objem BAL

16 ± 1,0

28,3 ± 0,9

počet AM x 10 6

7,2 ± 0,8

5,4 ± 0,8

počet T II x 10 6

7,1 ± 2,3

3,8 ± 1

DNA zlomy (AU) v AM

49,3 ± 11,7

73,0 ± 12,8**

DNA zlomy s oxidovanými purínmi (AU) v AM

66,3 ± 18,6

64,8 ± 15,5

DNA zlomy s oxidovanými pyrimidínmi (AU) v AM

71,0 ±2,0

75,8 ± 14,0

DNA zlomy (AU) v TII

58,5 ± 5,3

59 ± 1,3

DNA zlomy s oxidovanými purínmi (AU) v TII

52,7 ± 10,1

83,7 ± 9,1**

DNA zlomy s oxidovanými pyrimidínmi (AU) v TII

60,0 ± 16,7

84,8 ± 1,9**

 

Výsledky sú priemery ± SEM; ** P< 0,001

AM - alveolárne makrofágy; TII- T2 bunky; AU- arbitrálne jednotky, BAL- bronchoalveolárna laváž.

 

Diskusia a záver

Počet a typ  buniek získaných BAL ako aj ich viabilita, fagocytová aktivita a stav aktivácie AM dávajú možnosť pochopiť potenciálny škodlivý účinok inhalovaného cigaretového dymu. V našej štúdii sme zistili, že 6 mesačná inhalácia cigaretového dymu počet celkových buniek ani AM v BAL, v porovnaní s kontrolnou skupinou, neovplyvnila.  Inhalované častice, ako aj ich depozit v pľúcach, sú prevažne vychytávané a eliminované  z organizmu  alveolárnymi makrofágmi. Pretože AM sú prvými bunkami, ktoré prichádzajú do styku s inhalovanou noxou, sú prioritne používané v in vivoin vitro experimentoch na zistenie cytotoxicity  inhalovaných škodlivín. Zohrávajú významnú úlohu v mechanizme, ktorý reguluje odpoveď  po ich expozícii. Vedľa ich prioritnej schopnosti fagocytovať, sú tiež významné imuno-regulačné a sekréčne bunky zahrnuté do obranného mechanizmu, ako aj  patogenézy mnohých pľúcnych ochorení. Vo fáze aktivácie uvoľňujú mnohé cytokíny, reaktívne kyslíkové intermediáty ako aj rôzne mediátory zápalovej odpovede – významné modulátory bunkového rastu a diferenciácie (6,7,8,9). AM sú predominantné bunky prítomné v  BAL a  zmena v  ich počte alebo funkcii určuje pľúcne poškodenie a charakterizuje patogenitu ako odpoveď k expozícii polutantov. V porovnaní s kontrolou sme u fajčiacej skupiny zistili významne zvýšené % nezrelých foriem AM. Zvýšenie nezrelých monocytových foriem AM môže byť ako následok patologickej reakcie po expozícii intenzívnemu cigaretovému fajčeniu, anorganickým vláknam atď., ako aj pri určitých intersticiálnych pľúcnych ochoreniach (sarkoidózy, silikózy, azbestózy) (10).

Čo sa týka  dvojjadrových buniek v BAL, tieto sa v laváži vyskytli vo zvýšenom počte (o 16,6 % viac), v porovnaní s kontrolnou skupinou, ale zvýšenie nebolo  štatisticky významné. Beňo a kol. vo svojej práci tak isto dokázali, že dvoj a viacjadrové bunky sú vhodným biomarkerom pľúcneho zápalu (11).

Diferenciálny obraz buniek, ako aj celkový počet buniek, sú dôležitými ukazovateľmi bunkovej analýzy v BAL. Expozícia škodlivým substanciám spôsobuje zmenu v diferenciálnom počte buniek BAL a to proporcionálnym zvýšením zápalových buniek PMNL a Ly. Zvýšenie zápalových buniek môže tiež navodiť aj redukcia absolutného počtu AM (6, 8).  Expozícia cigaretovému dymu v našom prípade významne znížila % AM a významne zvýšila % PMNL a LY (diferenciálny obraz BAL buniek). PMNL tvoria dôležitú časť diferenciálneho obrazu buniek, najmä v akútnej fáze – ako odpoveď k expozícii inhalovaným škodlivinám (6).  Froudarakis et al. zistili u fajčiarov významné zvýšenie neutrofilov. (12).  Podľa  Dziedzica et al.  dlhodobá perzistencia týchto vlákien a tým navodené zvýšenie PMN môže byť akýmsi prediktorom vývoja metaplastických procesoch v pľúcach (6).

Zníženie počtu makrofágov, viability a fagocytovej kapacity môže vyústiť  do oslabeného clearence inhalovaných častíc (teda aj cigaretového dymu), čo môže následne viesť k zvýšeniu účinnej dávky potenciálnej  škodliviny (6,8).  Naša štúdia poukázala na štatisticky významne zníženú viabilitu  a fagocytovú aktivitu AM, čo svedčí o oslabení obrannej schopnosti organizmu v dôsledku cigaretového fajčenia. 

Molekula DNA nie je inertná ako by sa mohlo zdať na základe úvah o stabilnom genóme, ale naopak, je neustále poškodzovaná veľkým množstvom rozmanitých faktorov. Mnohé modifikácie DNA sú celkom náhodné a môžu nastať pri bežných procesoch bunky, ako je replikácia, či rekombinácia. Zmeny v DNA sú dôsledkom pôsobenia množstva fyzikálnych a chemických prvkov, z ktorých niektoré sú endogénneho pôvodu, čiže vznikajú ako produkty bunkového metabolizmu, kým iné môžu ohroziť stabilitu štruktúry DNA z vonkajšieho prostredia a teda sú pôvodom exogénne. Výsledky výskumov dokazujú, že oxidačné poškodenie DNA zohrávajú významnú úlohu pri vzniku a progresi mnohých ochorení. Nahromadenie oxidačných poškodení v bunke prispieva k  procesu karcinogenézy, neurodegeneratívnym, kardiovaskulárnym a iným ochoreniam a zúčastňuje sa aj na procese starnutia a bunkovej smrti. Proti toxickému pôsobeniu reaktívnych metabolitov kyslíka má organizmus vybudované ochranné mechanizmy, ktorými buď odstraňuje poškodené miesta DNA, alebo znemožňuje tvorbu voľných radikálov, resp. ak sa už vytvorili, znižuje ich negatívne dôsledky (13).

Expozícia potenciálnym chemickým mutagénnym a karcinogénnym látkam spúšťa v organizme kaskádu procesov od absorbancie, metabolickej premeny až po poškodenie cieľových molekúl, vrátane DNA, a vznik mutácií. Na sledovanie týchto procesov sa používajú biomarkery s cieľom odhaliť mechanizmus genotoxicity, karcinotoxicity ako aj individuálnu odpoveď na prítomnosť karcinogénnych látok v organizme. Výsledky subchronického účinku fajčenia na oxidačné poškodenie sú udané v tabuľke 2.

Výsledky prezentovanej štúdie potvrdili, že šesťmesačná inhalácia cigaretového dymu (8 cigariet denne) štatisticky významne - voči kontrole - ovplyvnila väčšinu nami vyšetrených parametrov BAL u potkanov. 

Prítomný zápalový proces a  významné zmeny bunkovej nešpecifickej obrany môžu signalizovať cytotoxický účinok  cigaretového dymu na pľúcne tkanivo.

Z výsledkou vyplýva, že exponovaná skupina potkanov má zvýšené oxidačné poškodenie v  porovnaní s  kontrolnou skupinou.

Dlhodobo zotrvávajúci zápal v pľúcach môže zohrávať významnú úlohu v  následnej genotoxicite, prípadne karcinogenicite cigaretového dymu, keďže ten je

 podľa IARC zaradený do skupiny 1 ako humánny karcinogén (aj u pasívnych

 fajčiarov).

 

 

Literatúra:

 

  1. World Health Organisation, Tobacco or Health: a Global Status Report, Geneva WHO; 1997, 495, ISBN 924156184 X.

  2. M. Aufderheide: Artificially Generated Cigarette Smoke – a Model for Studying Komplex Atmospheres,  Fraunhofer ITEM News Report; Ed.: Dillitzer, A and Straudi, A., Hannover, Germany. 2005, 1-2.

  3. International Agency for Research on Cancer. Tobacco Smoke and Involuntary Smoking. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Lyon, France; 2004, Vol. 83, 334, ISBN 92 832 1283 5.

  4. Myrvik, Q.N., Leake, E.S. and Fariss, B.: Studies on pulmonary alveolar macrophages  from the normal rabbit. A technique to procedure them in a high state of purity. J. Immunol. 1961, 86, 128-132. 

  5. Hurbánková, M. and  Kaiglová, A.:  Compared effects of asbestos and wollastonite fibrous  dusts on various biological parameters measured in bronchoalveolar lavage fluid, J. Trace and  Microprobe Techniques, 1999, 17, 233-243. 

  6. Dziedzic, D.,  Wheeler, C. S., Gross, K. B.: Bronchoalveolar  lavage: detecting markers of lung injury, 99-113. In: Handbook of Hazardous Materials.  (Corn M editor),  Academic  Press, New York; 1993, 772, ISBN 0-12-189410-X.

  7. Hurbánková, M., Kaiglová, A., Buchancová, J.: Cytokines – the important biomarkers of lung injury after exposure to industrial fibrous dusts, Acta Medica Martiniana, 2001, 1, 19 – 24.

  8. Pittet, J.F., Mackensie, R. C., Martin, T.R., Matthay,  M.A.:  Biological Markers  of  Acute Lung Injury: Prognostic and Pathogenetic Significance, Am J Respir Crit Care Med,  1997, 155, 1187-1205.

  9. Tarkowski, M., Gorski, P.: Macrophage activity in asbestos related diseases, Polish  Occup. Med. Environ. Health, 1991, 4, 115 - 25.

  10. Buchancová, J.: Choroby pľúc a pleury z azbestu, 585-594. In: BUCHANCOVÁ, J. a kol.: Pracovné lekárstvo a toxikológia, 1. vyd., Martin, Osveta; 2003, 1133, ISBN 80-8063-113-1.

  11. Beňo, M., Hurbánková, M., Dušinská, M., Volkovová, K., Staruchová, M., Černá, S., Barančoková, M., Kažimírová, A., Kováčiková, Z., Bobek, P., Horecký, M., Mikulecký, M., Kyrtopoulos, S.A.: Some lung cellular parameters reflecting inflammation of amosite dust with cigarette smoke by rats, Cent Eur J Publ Health, , 2004, 11-13.

  12. Froudarakis, M.E., Fournel, P., Costes, F., Perrin-Cottier, M., Blanchard, O., Sébastien, P., Vergnon, J.M.:  Metabolism of ceramic fibers in humans,  In: Abstract Book from 6th International Conference on Bronchoalveolar Lavage, Corfu, 1998,  33.

  13. Wiesmuller, L., Ford, J. M., Schiestl, R.H.: DNA damage, repair and diseases, Journal of Biomedicine and Biotechnology,  2002, 21- 45.

 

Táto práca bola podporovaná MZ SR v rámci projektu Obranné mechanizmy a patogenéza pľúcnych ochorení po expozícii pevným aerosólom a fajčeniu v experimente (19-10-07) a APVV v rámci projektu Respiračná toxicita a patomechanizmus pľúcnych ochorení vzniknutých po expozícii priemyselným minerálnym  vláknitým prachom – substitútom za azbest (APVT -21-01110).